Wie funktioniert der RT-PCR-Test?

Der RT-PCR-Test (Real Time-Polymerase Chain Reaction) oder auch qPCR-Test (quantitative PCR) ist eine quantitative Methode, mit der die Menge vorhandener RNA-Sequenzen ermittelt werden kann. Er eignet sich zum Nachweis von Viren, die Erbinformation in Form von RNA enthalten (u. a. SARS-CoV-2). Bei dem RT-PCR-Test geht es rein um die quantitative Bestimmung von viraler RNA im Nasen-Rachen-Raum. Eine Infektion, also ob der Organismus durch die eingedrungenen Krankheitserreger eine lokale oder allgemeine Störung erfährt, wird nicht berücksichtigt. Der RT-PCR-Test unterscheidet sich von dem gewöhnlichen PCR-Test, bei dem DNA-Sequenzen bestimmt, jedoch nicht quantifiziert werden. 

Eine hohe Spezifität ist also erforderlich.

Im Falle von COVID-19 wird das Vorhandensein von bestimmter viraler RNA im Nasen-Rachenraum untersucht. Wird virale RNA gefunden, wird die Menge (Kopien/ml) berechnet. Somit ist der RT-PCR-Test durchaus für diagnostische Zwecke geeignet. Da mittels der RT-PCR nur bestimmte Sequenzen, also nur Ausschnitte aus der Gesamt-RNA, ermittelt werden können, muss äußerst behutsam bei der Auswahl der Sequenzen vorgegangen werden: Sämtliche Varianten (Mutationen) des humanen SARS-CoV-2-Virus sollen erkannt werden, jedoch SARS-CoV-2-Sequenzen anderer Organismen (Fledermaus, Schuppentier, Katze,…), sowie MERS- und andere Coronaviren sollen nicht erkannt werden. Eine hohe Spezifität ist also erforderlich. 

 Laut FDA-Protokoll müssen zugleich zwei verschiedene Regionen (Sequenzen) des Virus und zusätzlich eine humane Sequenz getestet werden. Diese humane Sequenz dient als interner Marker. Bei jedem Abstrich wird ja neben viraler auch zwangsläufig menschliche RNA mit abgenommen, da diese ebenfalls im Nasen-Rachen-Raum vorhanden ist. Diese muss in jedem Fall nachweisbar sein, gleichgültig ob zusätzlich virale RNA detektiert werden kann (Testergebnis: positiv) oder nicht (Testergebnis negativ) und dient somit zur Qualitätskontrolle. 

Viele RT-PCR Nachweisverfahren von SARS-CoV-2 wegen Dringlichkeit sehr schnell und ohne umfassende Überprüfung eingeführt

Es gibt kein allgemeingültiges Protokoll für den Nachweis von SARS-CoV-2: Je nach Testlabor werden unterschiedliche Virus-Sequenzen analysiert. Manche Labore testen Sequenzen des Open Reading Frame 1ab (ORF1ab) oder des Nukleokapsid-Gen (N), andere Labore hingegen analysieren Sequenzen, welche die Erbinformation für der Virushülle (Envelope) oder für die RNA-Polymerase von SARS-CoV-2 beinhalten. Damit das Gesamt-Testergebnis positiv ausfällt, müssen mindestens eine Virus-RNA-Sequenz, sowie der interne Marker (die humane Sequenz) ein positives Ergebnis liefern [1]. 

In der Regel werden neue Diagnostikverfahren sorgfältig validiert, bevor sie weitläufig Anwendung finden. Viele RT-PCR Nachweisverfahren von SARS-CoV-2 wurden jedoch wegen der Dringlichkeit sehr schnell und ohne umfassende Überprüfung eingeführt. Eine gründliche Validierung würde wochenlange Testungen in Anspruch nehmen. Noch dazu waren weitgehend die Hersteller selber für die Inbetriebnahme der neuen Verfahren zuständig [2]. 

Aber wie ist der Ablauf eines RT-PCR-Nachweisverfahrens?

Dem Patienten wird zunächst einmal Probenmaterial aus den oberen Atemwegen (Nasopharynx, Oropharynx) oder den tiefen Atemwegen (Bronchioalveolarspülung, Auswurf, Trachealsekret) entnommen. In diesen Bereichen kann von einer ausreichenden Virenlast ausgegangen werden, falls die getestete Person mit COVID-19 infiziert ist. Der Nasopharynxabstrich wird standardmäßig entnommen [1][3][4]. Der Rachenabstrich wird von den meisten Personen jedoch als angenehmer empfunden. Die Sensitivität ist ähnlich oder nur geringfügig verringert [5][6][7]. Das Probenmaterial wird für den anschließenden Transport in ein Probengefäß gegeben, in dem sich eine Flüssigkeit befindet, die RNA-denaturierende Proteine inaktiviert, so dass die von Natur aus instabile RNA erhalten bleibt. Eine Kühlung (4°C) verlängert die Haltbarkeit der RNA [4]. Im Labor wird die gesamte RNA des Proberöhrchens, also Virus-RNA und menschliche RNA, zunächst aufgereinigt und isoliert. Mittels einer Reversen Transkriptase wird die komplette RNA in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Diese kann nun für den RT-PCR-Test eingesetzt werden. Die RT-PCR nutzt die cDNA als Basis für die Analyse. Zusätzlich werden fluoreszierenden Nukleotide (die einzelnen DNA-Bausteine, die anschließend zu DNA-Sequenzen zusammengebaut werden), Primer (Anfangssequenzen), und das Enzym Taq-Polymerase benötigt. 

Im ersten Zyklus binden nun die Primer an die passende cDNA-Sequenz. Diese Primer sind äußerst spezifisch. Möchte man SARS-CoV-2 nachweisen, benötigt man Primer, die ausschließlich auf SARS-CoV-2-Sequenzen passen (1). Ist die Testperson gesund und im Probenmaterial befindet sich keinerlei SARS-CoV-2-RNA sind keine passenden Sequenzen vorhanden, an denen die Primer binden können (Abb. 2). Die Reaktion bricht daher ab und ist somit vorzeitig beendet (Abb. 2). Die Bindung der Primer an die Sequenzen ist nämlich Voraussetzung, dass die Taq-Polymerase überhaupt arbeiten kann. Nur dann kann die Taq-Polymerase die freien Nukleotide einbauen und die Sequenzen vervollständigen (2). Aus einer Einfachsequenz wird ein Doppelstrang erzeugt (3). Durch Erhitzung wird der Doppelstrang anschließend wieder in zwei Einzelstränge getrennt. Nun sind doppelt so viele Vorlagen im Vergleich zur Anfangssituation vorhanden. Diese dienen erneut als Template für die Bildung weiterer Sequenzen (4). Aus zwei Einzel-DNA-Strängen werden nun zwei Doppelstränge gebildet (5). Mit jedem weiteren Zyklus findet nun eine Verdoppelung der Sequenzen statt (6), bis eine Sättigung erreicht wird, wenn keine freien Nukleotide mehr zur Verfügung stehen. 

Abbildung 1: Prinzip des RT-PCR-Tests 

Abbildung 2: Primer passt nicht auf die Sequenz, keine Vermehrung von cDNA-Sequenzen möglich. 

Der Ct-Wert (Cycle treshold, Schwellenwertzyklus) beschreibt jenen Schwellenwert an dem eine bestimmte Menge an Sequenzen gebildet werden konnten (Abb. 3). Zur Erinnerung: Ist keine Virus-RNA im Abstrich, und somit im der Probe enthalten, werden gar keine Sequenzen gebildet und der Schwellenwert wird nicht erreicht. Ist die Viruslast sehr hoch, dann wird dieser Grenzwert früher erreicht. Ein Beispiel: Ist z. B. viel SARS-CoV-2-Material in der Probe, wird der Grenzwert schon nach 17 Zyklen angetroffen. Man spricht dann von einem Ct-17-Wert. Ist die Virenlast im Proberöhrchen sehr gering, dann werden wesentlich mehr Zyklen benötigt, um diese bestimmte Menge an SARS-CoV-2-Sequenzen zu erzeugen und den Schwellenwert zu erreichen. Beispielsweise werden dann dafür 34 Zyklen benötigt. In diesem Fall würde man von einem Ct-34-Wert sprechen. 

Abbildung 3: Der Ct-Wert beschreibt jenen Schwellenwert, bei dem eine bestimmte Menge an Sequenzen gebildet wurden [8]. 

Die Anzahl der Gesamtzyklen spielt keine Rolle

Das Mitlaufen zweier Positiv- und einer Negativprobe ist zwingend erforderlich. Die Negativprobe sollte keine Kurve ergeben. Dadurch kann Verunreinigung ausgeschlossen werden. Die Positivkontrollen sind relevante Kenngrößen, die bei jedem Lauf ähnliche Ct-Werte ergeben sollten. Damit kann die Güte der generierten Messwerte beurteilt werden. Laufen die Kontrollkurven ungültig, so ist der ganze Lauf nicht verwertbar und auch die Patientenergebnisse müssen verworfen werden. Der Ct-Wert alleine hat noch keinerlei Aussagekraft, da verschiedene Faktoren (Probenvolumen, Verdünnung, etc.) Einfluss darauf haben. Er dient lediglich als Rechengrundlage für die Ermittlung der Viruslast des Patientenabstriches. Diese wird in Kopien/ml angegeben. Außerdem muss stets ein Bezug zu den Positivkontrollen genommen werden. Die Konzentration der beiden mitgeführten Kontrollproben sollte 10.000.000 Kopien/ml, wie auch 1.000.000 Kopien/ml betragen. Durch den Vergleich zu den Positivkontrollen, die somit als Standard dienen, kann die Menge der Kopien berechnet werden. Als hypothetisches Beispiel: Kontrollprobe 1 ergibt stets einen Ct-Wert von 28 und beinhaltet 10.000.000 Kopien/ml. Ein Ct-Wert von 27, also um 1 Zyklus niedriger als die Kontrollprobe, bedeutet, dass doppelt so viele SARS-CoV-2-Kopien im Probegefäß vorhanden sind, da der Schwellenwert schon ein Zyklus früher erreicht wurde Das wären somit 20.000.000 Kopien/ml. Beträgt der Ct-der Probe jedoch 29, wären es 5.000.000 Kopien/ml, bei 30 wären es somit 2.500.000 Kopien/ml. Die Anzahl der Gesamtzyklen, mögen es nun 40 oder 45 sein, spielt dabei keine Rolle und hat keinen Einfluss auf ein positives oder negatives Testergebnis. 

Die Menge des entnommenen Abstrichs ist also irrelevant für das Endergebnis

Wie bereits erwähnt, wird pro Person neben zwei SARS-CoV-2-Sequenzen auch eine körpereigene Sequenz (z. B. eine humane RNase P) als interne Kontrolle untersucht. Durch diese körpereigene Sequenz erhält man zwei Aussagen: zum einem dient sie als Nachweis, dass der Patientenabstrich erfolgreich war und keine RNA während des Transportes kaputt gegangen ist. Denn körpereigene RNA muss in jedem Fall nachweisbar sein, ganz egal ob der Patient mit SASR-CoV-2 infiziert ist oder nicht. Zum anderen benötigt man diese Information, damit der Anteil der viralen RNA mit dem Anteil der humanen RNA verrechnet werden kann. Somit ergibt sich die tatsächliche Viruslast und es ist ausgeschlossen, dass durch die Entnahme von besonders viel Probenmaterial eine hohe Kopienzahl ermittelt wird. Die Menge des entnommenen Abstrichs ist also irrelevant für das Endergebnis. 

Jede Person mit Viruslast höher als 10 hoch6 Kopien/ml gilt als positiv

Derzeit gilt jede Person, dessen Viruslast höher als 10 hoch 6 Kopien/ml beträgt als positiv. Werden weniger Kopien/ml ermittelt, gilt das Testergebnis als negativ [4]. Wissenschaftliche Studien ergaben, dass bei einer Viruslast von 10 hoch 6 Kopien/ml eine COVID-19-Anzuchtwahrscheinlichkeit bei maximal 10% liegt, also die Wahrscheinlichkeit, dass sich der Virus im Körper erfolgreich ausbreiten kann, gilt dann als gering. Je nach Studie variieren die Werte und liegen sogar darunter [5][9]. 

Seit Kurzem gibt es zur Untersuchung größerer Probenmengen sogenannte PCR-Hochdurchsatz-Vollautomaten. Dadurch wird die Testung mehrerer Tausend Proben pro Tag ermöglicht [10]. 

[1] Jiangsu Bioperfectus Technologies, “COVID-19 Coronavirus Real Time PCR Kit,” no. Ivd, pp. 1–5, 2020, [Online]. Available: https://www.fda.gov/media/139279/download. 

[2] M. Colindres, “Wie zuverlässig sind Corona-Tests ? COVID-19-Methoden-Special : SARS-CoV-2-Test-Vergleich,” Laborjournal, 2020, [Online]. Available: https://www.laborjournal.de/rubric/methoden/methoden/v232.php. 

[3] World Health Organization, “Laboratory testing for coronavirus disease 2019 (COVID-19) in suspected human cases,” no. March, pp. 1–7, 2020. 

[4] Sars-CoV-2, “Hinweise zur Testung von Patienten auf Infektion mit,” 2021, [Online]. Available: https://www.rki.de/DE/Content/InfAZ/N/Neuartiges_Coronavirus/Vorl_Testung_nCoV.html. 

[5] R. Wölfel et al., “Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019,” Nature, vol. 581, no. 7809, pp. 465–469, 2020. 

[6] S. A. Kujawski et al., “Clinical and virologic characteristics of the first 12 patients with coronavirus disease 2019 (COVID-19) in the United States,” Nat. Med., 2020. 

[7] R. Lu et al., “Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding,” Lancet, vol. 395, no. 10224, pp. 565–574, 2020.

[8] “Real-time PCR,” 2006, [Online]. Available: https://www.uni-giessen.de/fbz/fsp/meu/methodenplattform/analysen2/real-time-pcr. 

[9] J. J. A. van Kampen et al., “Duration and key determinants of infectious virus shedding in hospitalized patients with coronavirus disease-2019 (COVID-19),” Nat. Commun., vol. 12, no. 1, pp. 1–6, 2021. 

[10] S. Kohmer, Niko; Rabenau, Holger, Ciesek, “SARS-CoV-2 : Der richtige Nachweis,” vol. 117, no. 17, 2020.